Лекция: Иммунологическая реакция, применяемая в медицинской практике. Реакция агглютинации, диагностическое значение. Классификация иммунологических реакций Непрямые иммунологические реакции

Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, потому что участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови.

Реакции между антителами и антигенами, которые происходят в живом организме, могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.

Серологические реакции иммунитета вошли в практику диагностики инфекционных болезней в конце XIX – начале ХХ века.

Использование реакций иммунитета с диагностической целью основано на специфичности взаимодействия антигена с антителом.

Определение антигенной структуры микробов и их токсинов позволило разработать не только диагностикумы и лечебные сыворотки, но и сыворотки диагностические. Иммунные диагностические сыворотки получают путем иммунизации животных (например, кроликов). Эти сыворотки используют для идентификации микробов или экзотоксинов по антигенной структуре при помощи постановки серологических реакций (агглютинации, преципитации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации и др.). Иммунные диагностические сыворотки, обработанные флюорохромом, используются для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний методом иммунной флюоресценции.

С помощью известных антигенов (диагностикумов) можно определять наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого (серологическая диагностика инфекционных заболеваний).

Наличие же специфических иммунных сывороток (диагностических) позволяет установить видовую, типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Внешнее проявление результатов серологических реакций зависит от условий ее постановки и физиологического состояния антигена.

Корпускулярные антигены дают феномен агглютинации, лизиса, связывания комплемента, иммобилизации.

Растворимые антигены дают феномен преципитации, нейтрализации.

В лабораторной практике с диагностической целью используют реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, связывания комплемента, торможения гемагглютинации и др.

Реакция агглютинации (РА)

Благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, реакция агглютинации получила широкое распространение в микробиологической практике для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов (реакция Видаля), сыпного тифа (реакция Вейгля) и др.

Реакция агглютинации основана на специфичности взаимодействия антител (агглютининов) с целыми микробными или другими клетками (агглютиногенами). В результате такого взаимодействия образуются частицы – агломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

В реакции агглютинации могут участвовать как живые, так и убитые бактерии, спирохеты, грибы, простейшие, риккетсии, а также эритроциты и другие клетки.

Реакция протекает в две фазы: первая (невидимая) – специфическая, соединение антигена и антител, вторая (видимая) – неспецифическая, склеивание антигенов, т.е. образование агглютината.

Агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой антигена.

Реакция агглютинации, как и любая серологическая реакция, протекает в присутствии электролитов.

Внешне проявление положительной реакции агглютинации имеет двоякий характер. У безжгутиковых микробов, имеющих только соматический О- антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток. Такая агглютинация называется мелкозернистой. Он происходит в течение 18 – 22 часов.

У жгутиковых микробов имеются два антигена – соматический О- антиген и жгутиковый Н- антиген. Если клетки склеиваются жгутиками, образуются крупные рыхлые хлопья и такая реакция агглютинации называется крупнозернистой. Она наступает в течение 2 – 4 часов.

Реакцию агглютинации можно ставить как с целью качественного и количественного определения специфических антител в сыворотке крови больного, так и с целью определения видовой принадлежности выделенного возбудителя.

Реакцию агглютинации можно ставить как в развернутом варианте, позволяющем работать с сывороткой разведенной до диагностического титра, так и в варианте постановки ориентировочной реакции, позволяющем в принципе обнаружить специфические антитела или определить видовую принадлежность возбудителя.

При постановке развернутой реакции агглютинации, с целью выявления в сыворотке крови обследуемого специфических антител, исследуемую сыворотку берут в разведении 1:50 или 1:100. Это обусловлено тем, что в цельной или мало разведенной сыворотке могут находиться нормальные антитела в очень высокой концентрации, и тогда результаты реакции могут быть неточными. Исследуемым материалом при этом варианте постановки реакции является кровь больного. Кровь берут натощак или не ранее чем через 6 часов после еды (в противном случае в сыворотке крови могут быть капельки жира, делающие ее мутной и непригодной для исследования). Сыворотку крови больного обычно получают на второй неделе заболевания, набирая стерильно из локтевой вены 3 – 4 мл крови (к этому времени концентрируется максимальное количество специфических антител). В качестве известного антигена используется диагностикум, приготовленный из убитых, но не разрушенных микробных клеток конкретного вида с конкретной антигенной структурой.

При постановке развернутой реакции агглютинации с целью определения видовой, типовой принадлежности возбудителя, антигеном является живой возбудитель, выделенный из исследуемого материала. Известными являются антитела, содержащиеся в иммунной диагностической сыворотке.

Иммунную диагностическую сыворотку получают из крови вакцинированного кролика. Определив титр (максимальное разведение, в котором обнаруживаются антитела), диагностическую сыворотку разливают по ампулам с добавлением консерванта. Эту сыворотку и используют для идентификации по антигенной структуре выделенного возбудителя.

При постановке ориентировочной реакции агглютинации на предметном стекле используют сыворотки с большей концентрацией антител (в разведениях не более чем 1:10 или 1:20).

Пастеровской пипеткой наносят на стекло по одной капле физиологического раствора и сыворотки. Затем к каждой капле добавляют петлей небольшое количество микробов и тщательно размешивают до получения гомогенной взвеси. Через несколько минут при положительной реакции в капле с сывороткой появляется заметное скучиванье микробов (зернистость), в контрольной капле остается равномерное помутнение.

Ориентировочной реакцией агглютинации чаще всего пользуются для определения видовой принадлежности микробов, выделенных из исследуемого материал. Полученный результат позволяет ориентировочно ускорить постановку диагноза заболевания. Если реакция плохо видна невооруженным глазом, ее можно наблюдать под микроскопом. В этом случае ее называют микроагглютинацией.

Ориентировочная реакция агглютинации, которая ставится с каплей крови больного и известным антигеном, называется кроваво – капельной.

Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РПГА)

Эта реакция по чувствительности превосходит реакцию агглютинации и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими и другими микроорганизмами.

РПГА позволяет обнаружить небольшую концентрацию антител.

В этой реакции участвуют таннизированные бараньи эритроциты или эритроциты человека с кровью I группы, сенсибилизированные антигенами или антителами.

Если в исследуемой сыворотке определяются антитела, то используются эритроциты, сенсибилизированные антигенами (эритроцитарный диагностикум).

В некоторых случаях, при необходимости определения различных антигенов в исследуемом материале, используют эритроциты, сенсибилизированные иммунными глобулинами.

Результаты РПГА учитывают по характеру осадка эритроцитов.

Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки (перевернутый зонтик).

При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска (пуговка) располагаются в центре дна пробирки.

Реакция преципитации (РП)

В отличие от реакции агглютинации антигеном для реакции преципитации (преципитиногеном) служат растворимые соединения, величина частичек которых приближается к размерам молекул.

Это могут быть белки, комплексы белков с липидами и углеводами, микробные экстракты, различные лизаты или фильтраты культур микробов.

Антитела, обуславливающие преципитирующее свойство иммунной сыворотки, называются преципитинами, а продукт реакции в виде осадка – преципитатом.

Преципитирующие сыворотки получают путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток.

Путем искусственной иммунизации можно получить преципитирующие сыворотки к любому чужеродному белку растительного и животного происхождения, также к гаптенам при иммунизации животного полноценным антигеном, содержащим данный гаптен.

Механизм реакции преципитации аналогичен механизму реакции агглютинации. Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. И в том, и в другом случае под влиянием иммунной сыворотки и электролитов наступает укрупнение взвешенных в жидкости частиц антигена (уменьшение степени дисперсности). Однако для реакции агглютинации антиген берется в виде гомогенной мутной микробной взвеси (суспензии), а для реакции преципитации – в виде прозрачного коллоидного раствора.

Реакция преципитации является высоко чувствительной и позволяет обнаруживать ничтожно малые количества антигена.

Реакция преципитации применяется в лабораторной практике для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний, а также в судебно – медицинской экспертизе.

В санитарной практике с помощью этой реакции определяют фальсификацию пищевых продуктов.

Реакцию преципитации можно ставить не только в пробирках, но и в геле, а для тонких иммунологических исследований антигена применяется метод иммунофореза.

Реакция преципитации в агаровом геле, или метод диффузной преципитации, позволяет детально изучить состав сложных водо – растворимых антигенных смесей. Для постановки реакции используют гель (полужидкий или более плотный агар). Каждый компонент, входящий в состав антигена, диффундирует навстречу соответствующему антителу с разной скоростью. Поэтому комплексы различных антигенов и соответствующих антител располагаются в различных участках геля, где и образуют линии преципитации. Каждая из линий соответствует только одному комплексу антиген – антитело. Реакцию преципитации обычно ставят при комнатной температуре.

Широкое распространение при изучении антигенной структуры микробной клетки получил метод иммунофореза.

Комплекс антигенов помещают в луночку, находящуюся в центре агарового поля, залитого на пластину. Через агаровый гель пропускают электрический ток. Различные антигены, входящие в комплекс, перемещаются в результате действия тока в зависимости от их электрофоретической подвижности. После окончания электрофореза в траншею, расположенную по краю пластины, вносят специфическую иммунную сыворотку и помещают во влажную камеру. В местах образования комплекса антиген – антитело появляются линии преципитации.

Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)

Реакция основана на способности антитоксической сыворотки нейтрализовать действие экзотоксина. Она применяется для титрования антитоксических сывороток и определения экзотоксина.

При титровании сыворотки к разным разведениям антитоксической сыворотки прибавляется определенная доза соответствующего токсина. При полной нейтрализации антигена и отсутствия не израсходованных антител наступает инициальная флокуляция.

Реакцию флокуляции можно применять не только для титрования сыворотки (например, дифтерийной), но и для титрования токсина и анатоксина.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином имеет большое практическое значение как метод определения активности антитоксических лечебных сывороток. Антигеном в этой реакции является истинный экзотоксин.

Сила антитоксической сыворотки определяется условными единицами АЕ.

1 АЕ дифтерийной антитоксической сыворотки - это то ее количество, которое нейтрализует 100 DLM дифтерийного экзотоксина. 1 АЕ ботулиновой сыворотки – ее количество нейтрализующее 1000 DLM ботулинового токсина.

Реакцию нейтрализации с целью определения видовой или типовой принадлежности экзотоксина (при диагностике столбняка, ботулизма, дифтерии и др.) можно проводить in vitro (по Рамону), а при определении токсигенности микробных клеток - в геле (по Оухтерлони).

Реакция лизиса (РЛ)

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки является ее способность растворять микробы или клеточные элементы, поступающие в организм.

Специфические антитела, обуславливающие растворение (лизис) клеток, называются лизинами. В зависимости от характера антигена они могу быть бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами и др.

Лизины проявляют свое действие только в присутствии дополнительного фактора – комплемента.

Комплемент, как фактор неспецифического гуморального иммунитета, обнаружен почти во всех жидкостях организма, кроме спинномозговой жидкости и жидкости передней камеры глаза. Довольно высокое и постоянное содержание комплемента отмечено в сыворотке крови человека и очень много его в сыворотке крови морской свинки. У остальных млекопитающих содержание комплемента в сыворотке крови различно.

Комплемент – это сложная система сывороточных протеинов. Он нестоек и разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение двух часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Однако, комплемент длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре.

Комплемент способствует лизису микробных клеток и эритроцитов.

Различают реакцию бактериолиза и гемолиза.

Суть реакции бактериолиза состоит в том, что при соединении специфической иммунной сыворотки с соответствующими ей гомологичными живыми микробными клетками в присутствии комплемента происходит лизис микробов.

Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии на эритроциты специфической, иммунной по отношению к ним сывороткой (гемолитической) в присутствии комплемента, наблюдается растворение эритроцитов, т.е. гемолиз.

Реакция гемолиза в лабораторной практике используется для определения тира комплемента, а также для учета результатов диагностических реакций связывания комплемента «Борде – Жангу» и «Вассермана».

Титр комплемента – это наименьшее его количество, которое обуславливает лизис эритроцитов в течение 30 минут в гемолитической системе в объеме 2,5мл. Реакция лизиса, как и все серологические реакции происходит в присутствии электролита.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Эту реакцию применяют при лабораторных исследованиях для обнаружения антител в сыворотке крови при различных инфекциях, а также для идентификации возбудителя по антигенной структуре.

Реакция связывания комплемента относится к сложным серологическим реакциям и отличается высокой чувствительностью и специфичностью.

Особенностью этой реакции является то, что изменение антигена при его взаимодействии со специфическими антителами происходит только в присутствии комплемента. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген». Комплекс «антитело – антиген» образуется только в том случае, если между антигеном и антителом, находящемся в сыворотке, имеется сродство.

Адсорбция комплемента на комплексе «антиген – антитело» может по - разному отразиться на судьбе антигена в зависимости от его особенностей.

Некоторые из антигенов подвергаются при этих условиях резким морфологическим изменениям, вплоть до растворения (гемолиз, феномен Исаева – Пфейфера, цитолитическое действие). Другие изменяют скорость передвижения (иммобилизация трепонем). Третьи погибают без резких деструктивных изменений (бактерицидное или цитотоксическое действие). Наконец, адсорбция комплемента может и не сопровождаться изменениями антигена, легко доступными для наблюдения (реакции Борде – Жангу, Вассермана).

По механизму РСК протекает в две фазы:
а) Первая фаза – это образование комплекса «антиген – антитело» и адсорбция на этом комплексе комплемента. Результат фазы визуально не видим.
б) Вторая фаза – это изменение антигена под влиянием специфических антител в присутствии комплемента. Результат фазы может быть видимым визуально или не видимым.

В случае, когда изменения антигена остаются недоступными для визуального наблюдения, приходится использовать вторую систему, выполняющую роль индикатора, позволяющую оценить состояние комплемента и сделать заключение о результате реакции.

Эта индикаторная система представлена компонентами реакции гемолиза, в составе которой находятся бараньи эритроциты и гемолитическая сыворотка, содержащая к эритроцитам специфические антитела (гемолизины), но не содержащая комплемент. Эта индикаторная система добавляется в пробирки через час после постановки основной РСК.

Если реакция связывания комплемента положительна, то образуется комплекс антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент. Поскольку комплемент используется в количестве необходимом только для одной реакции, а лизис эритроцитов может произойти только при наличии комплемента, то при его адсорбции на комплексе «антиген – антитело», лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если реакция связывания комплемента отрицательная, комплекс «антиген – антитело» не образуется, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.

Реакция гемагглютинации (РГА)

В лабораторной практике пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.

В одном случае реакция гемагглютинации относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения группы крови.

В другом случае реакция гемагглютинации не является серологической.

В ней склеивание эритроцитов вызывают не антитела, а особые вещества (гемагглютинины), образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует куриные эритроциты, вирус полиомиелита – обезьяньи. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.

Учет результатов реакции осуществляется по расположению эритроцитов. При положительном результате эритроциты располагаются рыхло, выстилая дно пробирки в виде «перевернутого зонтика». При отрицательном результате эритроциты оседают на дно пробирки компактным осадком («пуговичка»).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т.е. тормозят реакцию гемагглютинации.

Высокая специфичность реакции торможения агглютинации позволяет с ее помощью определять вид, тип вирусов или выявлять специфические антитела в исследуемой сыворотке.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция основана на том, что иммунные сыворотки, к которым химическим путем присоединены флюорохромы, при взаимодействии с соответствующими антигенами, образуют специфический светящийся комплекс, видимый в люминесцентном микроскопе. Сыворотки, обработанные флюорохромами, называются люминесцирующими.

Метод высокочувствителен, прост, не требует выделения чистой культуры, т.к. микроорганизмы обнаруживются непосредственно в исследуемом материале. Результат можно получить через 30 минут после нанесения на препарат люминесцирующей сыворотки.

Реакцию иммунной флюоресценции применяют при ускоренной диагностике многих инфекций.

В лабораторной практике применяют два варианта реакции иммунофлюоресценции: прямой и непрямой.

Прямой метод – это когда антиген сразу обрабатывается иммунной флюоресцирующей сывороткой.

Непрямой метод иммунной флюоресценции заключатся в том, что изначально препарат обрабатывают обычной (не флюоресцирующей) иммунной диагностической сывороткой, специфической искомому антигену. Если в препарате имеется антиген специфический к данной диагностической сыворотке, то образуется комплекс «антиген – антитело», который увидеть нельзя. Если этот препарат дополнительно обработать лиминесцирующей сывороткой, содержащей специфические антитела к глобулинам сыворотки в комплексе «антиген – антитело», произойдет адсорбция люминесцирующих антител на глобулины диагностической сыворотки и как результат – в люминесцентный микроскоп можно увидеть светящиеся контуры микробной клетки.

Реакция иммобилизации (РИ)

Способность иммунной сыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана со специфическими антителами, которые проявляют свое действие в присутствии комплемента. Иммобилизирующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях.

Это послужило основанием для разработки реакции иммобилизации трепонем, которая по своей чувствительности и специфичности превосходит другие серологические реакции, используемые при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция нейтрализации вирусов (РНВ)

В сыворотке крови людей, иммунизированных или перенесших вирусное заболевание, обнаруживаются антитела, способные нейтрализовать инфекционные свойства вируса. Эти антитела выявляются при смешивании сыворотки с соответствующим вирусом и последующим введением этой смеси в организм восприимчивых лабораторных животных или заражением культуры клеток. На основании выживания животных или отсутствия цитопатического действия вируса судят о нейтрализующей способности антител.

Эта реакция широко используется в вирусологии для определения вида или типа вирус и титра нейтрализующих антител.

К современным методам диагностики инфекционных заболеваний следует отнести иммунофлюоресцентный метод обнаружения антигенов и антител, радиоимунный, иммуноферментный метод, метод иммуноблоттинга, обнаружение антигенов и антител при помощи моноклональных антител, метод обнаружения антигенов при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР – диагностика) и др.

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

1. Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

Рис. 2. РА на стекле.

На предметное стекло наносят каплями:

1 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;
3 -ья капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий . Перемешивают.

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа.

2. Учет результатов РНГА , поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками . Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

Учет зонтик пуговки или колечка.

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

Реакция преципитации – это формированиеи осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

3. Постановка и учет реакции кольцепреципитации для определения видовой принадлежности кровяного пятна.

Постановка . В узкую пробирку №1 диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой против белков крови человека в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена (экстракт кровяного пятна ). В пробирку №2 приливают преципитационную сыворотку против белков барана, в пробирку №3 - физиологический раствор (контроль) и добавляют также, как в первую пробирку антиген. Пробирки осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.
Учет . Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.

4. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре .

Эта издавна используемая реакция преципитации, предложенная для определения токсичности коринебактерий дифтерии, ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри. Вдоль ее посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой . После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры. В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная, должна быть заведомо токсигенной. Посевы помещают в термостат.

Учет реакций проводят через 24-48-72 ч. Если культура токсигенная, на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата, совпадающие с линиями преципитата контрольной культуры. Они имеют вид «стрел-усиков », которые хорошо видны в проходящем свете.

Рис. 5. Реакция преципитации в агаре.

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

5. Постановка непрямой реакции гемагглютинации (РНГА ) выявления титра специфических антител у больного.

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика).
Постановка . В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.
Учет . В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик ), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

Рис. 6. Результат РНГА. Титр антител - 1:100.

6. Постановка развернутой реакции агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр ). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий, с которыми безопасно работать.
Ставят реакцию следующим образом. В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками:++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; - - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).
За титр сыворотки принимают последнее ее разведение , в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

Вопрос № 26

(иммунологические реакции: агглютинации, преципитации, лизиса)

Реакции агглютинации
В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.
Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин) и 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Примечание : положительный результат - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината

Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.

^ Ориентировочная реакция агглютинации (РА) Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки. Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.

Реакции прямой гемагглютинации. Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов .

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др

Реакция преципитации позволяет определить в исследуемом материале присутствие неизвестного антигена путем добавления известного антитела или при помощи известного антигена - неизвестное антитело. Преципитация регистрируется лучше, если антиген наслаивать в пробирке на антитело. При этом наблюдается появление преципитата в виде кольца - кольцепреципитация. Кольцепреципитацию проводят в специальных пробирках

Преципитация в агаре позволяет определять токсигенность дифтерийных культур.
В судебно-медицинских исследованиях преципитация служит для установления видовой принадлежности крови, органов и тканей с помощью специфических преципитирующих сывороток.
Реакция лизиса

В основе лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплимента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации холерных и холероподобных вирионов)
^ Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с АТ-ми в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. Реакция гемолиза используется как индикаторное при постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК), для титрования комплемента и гемолитической сыворотки.
^ Реакция локального гемолиза в геле -является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток в лимфоидных органах.

Вопрос№27

(Иммунные сыворотки. Титр агглютинирующий, испытуемой сыворотки, диагностический титр. Диагностикумы, их виды)
Сы воротки имму нные, препараты из крови животных и человека, содержащие антитела против возбудителей инфекционных заболеваний или продуктов их жизнедеятельности. Применяются длясеродиагностики , серопрофилактики и серотерапии . В процессе приготовления С. и. сыворотка крови иммунизированных определёнными антигенами животных или людей (доноров) либо переболевших подвергается различной, в зависимости от типа и назначения С. и., обработке: очистке, при которой удаляются балластные вещества и выделяются активные, прежде всего глобулиновые, фракции белков; концентрации.

Введение человеку С. и. из крови животных может сопровождаться осложнениями (сывороточная болезнь , анафилактический шок). Концентрированные С. и. - гамма-глобулины (правильнее - иммуноглобулины, так как в них сохраняются различные глобулиновые фракции) из крови человека - практически не вызывают этих осложнений и медленнее выводятся из организма. В зависимости от назначения различают лечебно-профилактические и диагностические С. и. Лечебно-профилактические С. и. подразделяют на антитоксические - против ядовитых продуктов жизнедеятельности микробов (например, противостолбнячная, противодифтерийная, противогангренозная) и против последствий укуса ядовитых змей и насекомых; антибактериальные - воздействующие на микроорганизм (противосибиреязвенный гамма-глобулин) и антивирусные (например, противокоревой, антирабический, противогриппозный гамма-глобулины). Диагностические С. и. готовят, применяя различные антигены в зависимости от характера реакции, для которой они используются. Их применяют для идентификации возбудителей инфекционных болезней, а также в экспериментальных исследованиях и др.

. Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других. Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления

(через 10-21 сут). Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.
Титр диагностический

титр Ат к конкретному возбудителю болезни в с-ке крови, выявляемый у большинства лиц на определенной фазе болезни и не наблюдающийся у большинства здоровых людей. Подтверждает клинический диагноз болезни.
Диагностикумы - это взвеси убитых микробов, чаще всего в физиологическом растворе, применяемые в качестве антигенов для серологических реакций .

Преимущество диагностикумов перед живой культурой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагностикумов дает возможность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бактериями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремийными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефалитов и др.).
Диагностикумы, используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отношению к определенному виду микроба-возбудителя.
Более тонкие различия антител в изучаемой сыворотке устанавливают при помощи специфических монодиагностикумов. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н-диагностикумы из культуры брюшнотифозных бактерий 0-901 или бактерий паратифа № 2, обладающих общим О-антигеном с брюшнотифозными бактериями; Н-диагностикум представляет собой взвесь бактерий, обладающих выраженной подвижностью .

Вопрос№28

(Люминесцентная,темнопольная,фазовоконтрастная,электронная микроскопия)
Люминесцентная микроскопия - оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нем
Темнопо́льная микроскопи́я - вид оптической микроскопии , в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата. В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца. Темнопольная микроскопия хорошо подходит для получения изображений живых и неокрашенных биологических образцов, таких, как отдельные водные одноклеточные организмы.

Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов - простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток
Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашеные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные - фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы
^ Электронная микроскопия - это метод исследования структур, находящихся вне пределов видимости светового микроскопа и имеющих размеры менее одного микрона (от 1 мк до 1-5 Å).
Действие электронного микроскопа основано на использовании направленного потока электронов , который выполняет роль светового луча в световом микроскопе, а роль линз играют магниты (магнитные линзы).
Вследствие того, что различные участки исследуемого объекта по-разному задерживают электроны, на экране электронного микроскопа получается черно-белое изображение изучаемого объекта, увеличенное в десятки и сотни тысяч раз.
Вопрос№30

(Микроскопический метод диагностики инфекционных болезней)
Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний позволяет выявить возбудителя непосредственно в материале от больного, пользуясь световым микроскопом. На основании анализа морфологических особенностей микроба можно достаточно точно определить его вид. Материалом для исследования могут быть кровь, костный мозг, мазки или смывы со слизистых оболочек полости рта и носа, моча, выделения из уретры, стул, спинномозговая жидкость, слюна, мокрота, гной из карбункулов или фурункулов и т.п

Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний позволяет выявить малярию, лейшманиоз, лямблиоз, гельминтозы и другие инфекционные заболевания

Вопрос№31

(Культуральный (бактериологический,вирусологический,микологический метод диагностики инфекционных заболеваний)
^ Микробиологическое (бактериологическое или вирусологическое) исследование Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и идентификации этого возбудителя . В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится 18- 24 часов.. Для выделения чистой культуры возбудителя делают посев взятого материала. Посев делается, как правило, на плотные питательные среды, которые выбирают исходя из свойств предполагаемого возбудителя.

На втором этапе бактериологического метода исслебования проводят изучение колоний бактерий, выросших на плотной питательной среде и происходящих от одной бактериальной клетки. (колония и является чистой культурой возбудителя). Производят микроскопическое и макроскопическое исследование колоний в отраженном и проходящем свете: невооруженным глазом, под малым увеличением микроскопа, с помощью лупы.

Бактериологическое исследование проводят также для контроля эффективности лечения больного, выявления реконвалесцентного бактерионосительства, источника возбудителя болезни в эпидемическом очаге, обследование лиц, принадлежащих к декретированным группам (работники пищевой промышленности, общественного питания, детских дошкольных учреждений и т.д.).

Выращивать и идентифицировать вирусы значительно тяжелее, чем бактерии. Прежде всего, это связано с тем, что вирусы размножаются только внутри живых клеток. Поэтому такие исследования проводят в специальных вирусологических лабораториях, используя вместо питательных сред культуры разных клеток: куриные эмбрионы, клетки тканей человека или животных.

Микологические исследования осуществляются реже, чем бактериологические, поскольку микроскопическая диагностика микозов достаточно надежна. Микологические исследования проводят при диагностике кандидозов путем определения нарастания количества клеток дрожжеподобных грибов рода Candida, а также глубоких микозов.

Вопрос№32

(Серологический метод диагностики инф. Болезней)

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитела, антиген) неизвестным является сыворотка крови. Постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами (диагностикумами). Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании “парных” сывороток крови больного, взятой в первые дни болезни и через разные промежутки времени от начала заболевания. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.

2. Установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Для этой цели используются диагностические иммунные сыворотки, полученные от животных после вакцинации соответствующими антигенами. Это серологическая идентификация микроорганизмов.

При инфекционных заболеваниях серологические исследования для обнаружения специфических антител являются более доступным методом лабораторной диагностики, чем бактериологическое выявление возбудителя. В ряде случаев серологические исследования являются единственным методом диагностики инфекционных заболеваний.
Методы серологических реакций

Вопрос№33

(Аллергический метод диагностики инфекционных заболеваний)
Аллергический метод позволяет поставить диагноз инфекционного заболевания с помощью аллергических проб - накожных и внутрикожных. Метод выявляет повышенную чувствительность замедленного типа, возникающую в организме при многих инфекционных заболеваниях. Введение аллергена накожно или внутрикожно используют для диагностики бруцеллеза, туляремии, токсоплазмоза и других заболеваний.
Аллергологический метод диагностики инфекционных заболеваний основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии, гиперсенсибилизации) при введении в детский организм специфических аллергенов. Аллергены применяют в небольшом количестве. В основном их вводят внутрикожно или наносят на кожу, реже - на слизистую оболочку глаза. Для постановки внутрикожной пробы используют туберкулиновый или инсулиновый шприц. Тонкой иглой срезом вверх вводят 0,1 мл аллергена в кожу внутренней поверхности предплечья. Вводить препарат начинают после того, как срез иглы полностью войдет в кожу. Если манипуляция выполнена правильно, на месте введения аллергена образуется небольшой беловатый, плотный пузырек, напоминающий лимонную корку. Он исчезает через 10-15 минут. При заболевании (наличия специфической аллергии) через 24-72 часа в месте введения аллергена возникает реакция в виде инфильтрации с покраснением.

Аллергические реакции становятся положительными с 8-10-го дня заболевания. Чаще всего их применяет для диагностики туберкулеза (реакция Манту), бруцельоза (реакция Бюрне), туляремии, токсоплазмоза, орнитоза.

Вопрос №34

(Биологический метод)

биологический метод - осуществляют путем выделения возбудителя при заражении лабораторных животных, которые восприимчивы к данному заболеванию. Этот метод дорогостоящий, поэтому применяется ограниченно;

Вопрос№34

(Молекулярно-генетический метод)
Всё более востребованными становятся молекулярно-генетические методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), «BROAD-R

В настоящее время из молекулярно-генетических методов исследования наиболее широкое применение в диагностике инфекционных болезней нашла ПЦР, которая благодаря появлению доступных и удобных в использовании приборов завоевала прочное место в повседневной работе лабораторий. В основе ПЦР лежит искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro.

Вопрос№36

(Характеристика возбудителя ВИЧ-инфекции. Принципы микробиологической диагностики. Препараты для специфического лечения)

Вирус иммунодефицита человека вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчивающуюся развитием синдрома приобретенного иммунного дефицита.

Возбудитель ВИЧ-инфекции - лимфотропный вирус, РНК-содержащий вирус. Вирусная частица сферической формы Оболочка состоит из двойного слоя липидов, пронизанного гликопротеинами. Липидная оболочка происходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула состоит из 2 субъединиц, находящихся на поверхности вириона и пронизывающих его липидную оболочку.

Сердцевина вируса конусовидной формы, состоит из капсидных белков, ряда матриксных белков и белков протеазы. Геном образует две нити РНК, для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.

Геном вируса состоит из 3 основных структурных генов и 7 регуляторных и функциональных генов. Функциональные гены выполняют регуляторные функции и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе.

Вирус поражает в основном Т- и В-лимфоциты, некоторые клетки моноцитарного ряда (макрофаги, лейкоциты), клетки нервной системы.Чувствителен к физическим и химическим факторам, гибнет при нагревании. Вирус может длительно сохраняться в высушенном состоянии, в высохшей крови.

Клиника: поражается дыхательная система (пневмония, бронхиты); ЦНС (абсцессы, менингиты); ЖКТ (диареи), возникают злокачественные новообразования (опухоли внутренних органов).

ВИЧ-инфекция протекает в несколько стадий: 1) инкубационный период, составляющий в среднем 2-4 недели; 2) стадия первичных проявлений, характеризующаяся вначале острой лихорадкой, диареей; завершается стадия бессимптомной фазой и персистенцией вируса, восстановлением самочувствия, однако в крови определяются ВИЧ-антитела, 3) стадия вторичных заболеваний, проявляющихся поражением дыхательной, нервной системы. Завешается ВИЧ-инфекция последней, 4-й терминальной стадией- СПИДом.

Вирусологические и серологические исследования включают методы определения антигенов и антител ВИЧ. Для этого используют ИФА, ИБ и ПЦР. ВИЧ-антитела появляются через 2-4 недели после инфицирования и определяются на всех стадиях ВИЧ.

Лечение:

применение ингибиторов обратной транскриптазы, действующих в активированных клетках. Препараты являются производные тимидина - азидотимидин и фосфазид.

Терапия ВИЧ-инфицированных лиц подразумевает постоянный контроль иммунного статуса организма, профилактику и лечение возникающих вторичных инфекций, контроль над развитием новообразований. Зачастую ВИЧ-инфицируемым лицам требуется психологическая помощь и социальная адаптация.

Вопрос№37

(Характеристика возбудителей вирусных гепатитов В,С,дельта. Принципы микробиологической диагностики, препараты для лечения гепатита В)
Вирус гепатита В - семейство Hepadnaviridae Морфология: ДНК-содержаший вирус сферической формы. Состоит из сердцевины, состоящей из 180 белковых частиц, составляющих сердцевинный НВс-антиген и липидсодержащей оболочки, содержащей поверхностный HBs-антиген. Внутри сердцевины находятся ДНК, фермент ДНК-полимераза, обладающая ревертазной активностью, и концевой белок НВе-антиген.Резистентность . Высокая к факторам окружающей среды и дезинфицирующим веществам. Вирус устойчив к длительному воздействию кислой среды, УФ-излучению, действию спирта, фенола.

Развитие инфекционного процесса при попадании в кровь. Заражение происходит при парентеральных манипуляциях (инъекциях, хирургических вмешательствах), переливании крови.Патогенез и клиника заболевания. Инкубационный период 3-6 месяцев. Инфекционный процесс наступает после проникновения вируса в кровь. ВГВ из крови эндоцитозом проникает в гепатоцит. После проникновения вируса происходит достраивание плюс-нити ДНК ДНК-полимеразой до полноценной структуры. Клиническая картина характеризуется симптомами поражения печени, в большинстве случаев сопровождается развитием желтухи.Иммунитет. Гуморальный иммунитет, представленный антителами к HBs-антигену, защищает гепатоциты от вируса, элиминируя его из крови.Клеточный иммунитет освобождает организм от инфицированных гепатоцитов благодаря цитолитической функции Т-киллеров. Переход острой формы в хроническую обеспечивается нарушением Т-клеточного иммунитета.

Микробиологическая диагностика. Используют серологический метод и ПЦР. Методами ИФА и РНГА в крови определяют маркеры гепатита В: антигены и антитела. ПЦР определяют наличие вирусной ДНК в крови и биоптатах печени. Для острого гепатита характерно обнаружение HBs антигена, НВе антигена и анти-HBc-IgMантитела.

Лечение. Использование интерферона, интерфероногенов: виферона, амиксина, ингибитора ДНК-полимеразы, препарата аденинрибоно-зида.

Профилактика. Существует вакцины первого поколения полученные из плазмы крови хронических носителей.Исключение попадания вируса при парентеральных манипуляциях и переливаниях крови (применением одноразовых шприцев, проверкой на гепатит В по наличию HBs-антигена в крови доноров крови).

Вирус гепатита D - дефектный вирус, не имеющий собственной оболочки. Вирион имеет сферическую форму, который состоит из однонитчатой РНК и сердцевинного HDc-антигена. Для репродукции данного вируса необходимо участие вируса-помощника,роль которого играет вирус гепатита В. Различают три генотипа вируса. Все генотипы относятся к одному серотипу.

Резервуаром BFD в природе являются носители ВГВ. Заражение BFD аналогично инфицированию ВГВ.

осуществляется серологическим методом путем определения антител к BFD методом ИФА. Профилактика: все те мероприятия, которые используют для профилактики гепатита В. Для лечения используют препараты интерферона. Вакцина против гепатита В защищает и от гепатита D.
Морфология. Сложноорганизованный РНК-содержащим вирус сферической формы. Геном представлен одной линейной «+» цепью РНК, обладает большой вариабельностью.

Антигенная структура. Вирус обладает сложной антигенной структурой. Антигенами являются: 1. Гликопротеины оболочки 2. Сердцевинный антиген НСс-антиген 3. Неструктурные белки.

Резистентность. Чувствителен УФ-лучам, нагреванию до 50С.

Эпидемиология. Наиболее часто ВГС передается при переливаниях крови, трансплацентарно, половым путем.

Клиника: Часто встречаются безжелтушные формы, течение инфекции в острой форме, в 50 % случаев процесс переходит в хроническое течение с развитием цирроза и первичного рака печени.

Микробиологическая диагностика: Используются ПЦР и серологическое исследование.

Вопрос№38

(Характеристика возбудителей полиомиелита. Принциы микробиологической диагностики. Препараты для спец. Профилактики и лечения)

Структура. По структуре полиовирусы - типичные представители рода Enterovirus. РНК-содержащие вирусы.
Морфология : мелкие, просто организованные вирусы, сферической формы, состоят из одноцепочечной РНК и капсида.

^ Антигенные свойства: Различают 3 серотипа внутри вида: 1, 2, 3, не вызывающие перекрестного иммунитета. Все серотипы патогенныдлчеловека.
Патогенез и клиника. Естественная восприимчивость человека к вирусам полиомиелита высокая. Входными воротами служат слизистые оболочки верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта. Первичная репродукция вирусов происходит в лимфатических узлах глоточного кольца и тонкой кишки. Из лимфатической системы вирусы проникают в кровь, а затем в ЦНС, где избирательно поражают клетки передних рогов спинного мозга (двигательные нейроны). Инкубационный период продолжается в среднем 7-14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную (без параличей), абортивную (легкая форма). Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле.

Иммунитет. После перенесенной болезни остается пожизненный иммунитет. Иммунитет определяется наличием вируснейтрализующих антител, среди которых важная роль принадлежит местным секреторным антителам слизистой оболочки глотки и кишечника (местный иммунитет). Пассивный естественный иммунитет сохраняется в течение 3-5 недель послерожденияребенка.

^ Микробиологическая диагностика . Материал для исследования - кал, отделяемое носоглотки, при летальных исходах - кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы.
Вирусы полиомиелита выделяют путем заражения исследуемым материалом первичных и перевиваемых культур клеток. О репродукции вирусов судят по цитопатическому действию. Идентифицируют выделенный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации в культуре клеток. Важное значение имеет внутривидовая дифференциация вирусов, которая позволяет отличить патогенные штаммы от вакцинных штаммов, выделяющихся от людей, иммунизированных живой полиомиелитной вакциной. Различия между штаммами выявляют с помощью ИФА, реакции нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток со штаммоспецифической иммунной сывороткой, а также вПЦР.
Серодиагностика основана на использовании парных сывороток больных с применением эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов IgG, IgA, IgM определяют методом радиальной иммунодиффузиипоМанчини.
Лечение . Патогенетическое. Применение гомологичного иммуноглобулина для предупреждения развития паралитических форм ограничено.
Все больные с подозрением на полиомиелит подлежат срочной госпитализации. Лечение проводят в условиях боксированного отделения инфекционного стационара в течении 3-4 недель. Основными критериями перехода болезни в восстановительный период являются исчезновение симптомов интоксикации, болевых признаков, нормализация ликвора (спинно-мозговой жидкости)

Профилактика . Основной мерой профилактики полиомиелита является иммунизация. Первая инактивированная вакцина для профилактики – создавала общий гуморальный иммунитет, не формировала местной резистентности слизистых оболочек ЖКТ, не обеспечивала надежную защиту.

Пероральная живая культуральная вакцина из трех серотипов штаммов. Используют для массовой иммунизации детей, она создает стойкий общий и местный иммунитет.

ПЛАН q 1. Серологические реакции, которые используются для серологической диагностики. q 2. Серологические реакции, которые используются для серологической идентификации. q 3. Современные методы Иммунологических исследований при инфекционных болезнях: (Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный анализ, генодиагностика, полимеразная цепная реакция). q 4. Серологические реакции, которые используются в вирусологии. q

РЕАКЦИИ ИСПОЛЬЗУЮТСЯ С ДВОЯКОЙ ЦЕЛЬЮ: q для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни; q для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками антителами – для серологической идентификации возбудителей.

КЛАССИФИАЦИЯ q Иммунные реакции подразделяются на простые и сложные. Для их постановки необходимы основные два компонента: антиген и антитело. q К простым реакциям, применяемым для диагностики, относятся реакции агглютинации, реакции преципитации, реакции нейтрализации. q К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный метод, радиоиммунный метод, иммуноферментный метод, иммунолюминесцентный метод исследования, метод иммуноблотинга.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ q Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. q Реакция протекает в две фазы. q В первой фа зе происходит специфическая дсорбция а антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, q Во второй - образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

АГГЛЮТИНАТ q Агглютинат может быть двух типов мелкозернистый и крупнохлопчатый. q Мелкозернистый – это результат взаимодействия мелких бактерий, q крупнохлопчатый – бактерий, имеющих жгутики.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ТИПЫ q Все реакции агглютинации подразделяются на два типа: q ориентировочные (ОРА), которые выполняются на стекле, q развернутые (РРА) – выполняются в пробирках с титрованием сыворотки.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ НЕДОСТАТОЧНО СПЕЦИФИЧНА И ЧУВСТВИ ТЕЛЬНА. q Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. q Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. q Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. q Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции. .

ОСНОВНЫЕ ЦЕЛИ q Ориентировочные реакции также могут иметь две цели: q Идентификация микробного вида (с использованием известной иммунной сыворотки). q Поиск антител в сыворотке крови пациента с использованием известного микробного диагностикума.

СХЕМА ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ. Этапы выполнения реакции: v На обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора. v Внести петлей исследуемую культуру бактерий, равномерно распределить в капле физиологического раствора v Добавить каплю специфической агглютинирующей иммунной сыворотки v Учесть результат реакции. v Положительной считается реакция, когда в капле происходит просветление жидкости и формирование агглютината.

ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА + + Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление жидкости. Результат положительный + + + Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над осадком слегка мутновата. Результат положительный + + Слабая агглютинация: осадок небольшой, жидкость непрозрачная. Результат слабоположительный + Следы агглютинации: осадок маленький, надосадочная жидкость непрозрачная. Сомнительный результат реакции Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.

МОДИФИКАЦИИ РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ: ЭТО РЕАКЦИЯ. МИНКЕВИЧА И РЕАКЦИЯ ХЕДДЕЛЬСОНА v Реакция Минкевича позволяет определить наличие противотуляремийных антител у инфицированного пациента. v Необходимые ингредиенты: v Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора из пальца больного v Дистиллированная вода v Туляремийный диагностикум.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ МИНКЕВИЧА: v На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента v Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов v Внести каплю туляремийного диагностикума v Учесть результаты. v Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна агглютината.

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента, но и определить титр антител. Необходимые ингредиенты: v Сыворотка пациента v Физиологический раствор v Бруцеллезный диагностикум

ПРИНЦИП МЕТОДА v основан на использовании большого стекла фотопластины, v концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в нарастающих или уменьшающихся объёмах, v дополняемой до определённого уровня физиологическим раствором, что приравнивается к разным разведениям, и v окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей видимости образующегося агглютината. v Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при +37 Сº. v На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от нескольких больных. v Результат получают через 2 5 минут в виде голубого агглютината разной активности в зависимости от разведений.

РЕАКЦИЮ АДСОРБЦИИ АГГЛЮТИНИНОВ ПО КАСТЕЛЛАНИ ПРИМЕНЯЮТ ДЛЯ ДЕТАЛЬНОГО ИЗУЧЕНИЯ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СЕРОВАРА: q Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. q При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию.

Принцип метода: v Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции v специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела - и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ - только групповые. v В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют родственные гетерологические АГ. v Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым паратифа А.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ ЛАТЕКСА (РАЛ) ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ(ОРИЕНТИРОВАЧНЫЙ ВАРИАНТ) q Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром 0, 5 1, 2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2 7 мин. q Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий. q Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. q Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т. д.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА). Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту Ig. G человека и кролика. Поэтому молекулы Ig. G после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

РЕАКЦИЯ КОАГГЛЮТИНАЦИИ (КОА). q Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1 2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. q Смесь тщательно перемешивают и через 2 5 мин. на тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ НАИБОЛЕЕ ИЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ v Основана на способности антител взаимодействовать с антигеном, фиксированным на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. v Для постановки этой реакции необходимо приготовление эритроцитарного диагностикума. v Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов: антигенный и антительный.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ: Необходимые ингредиенты: q Сыворотка крови инфицированного пациента q В лунки планшета внести физиологический раствор в одинаковом количестве 0, 25 мл для разведения сыворотки q В первую лунку внести сыворотку крови пациента, разведенную в 50 раз в объеме 0, 25 мл; перемешать содержимое пипеткой и этой же пипеткой набрать 0, 25 мл и перенести в следующую лунку q Перемешать содержимое и повторить эту процедуру во всех лунках, предназначенных для проведения реакции. q Приготовить контроль, для чего в одну лунку внести 0, 25 мл физиологического раствора q Во все лунки, включая контрольную, внести по 2 капли приготовленного эритроцитарного диагностикума и перемешать путем осторожного покачивания планшета. q Физиологический раствор q Эритроцитарный диагностикум q Реакция пассивной гемагглютинации выполняется в лунках иммунологического планшета.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ Положительной считается проба, когда в лунках планшета на дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки» , а в опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика» . Схема постановки и учета РПГА

КРИТЕРИИ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ + + Полная агглютинация: осадок занимает все дно лунки. Результат положительный + + + Неполная агглютинация: осадок занимает три четверти дна лунки. Результат положительный + + Слабая агглютинация: осадок занимает менее половины дна лунки. Результат сомнительный + Следы агглютинации: осадок небольшой. Сомнительный результат реакции Отрицательная реакция: осадок занимает центральное положение с округлыми краями.

. РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ v Развернутые реакции агглютинации предложены для поиска антител в сыворотках крови инфицированных пациентов при некоторых бактериальных инфекциях. v При этом применяются диагностикумы, приготовленные из микроорганизмов. v Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ЭТИХ РЕАКЦИЙ НЕОБХОДИМО ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ СЫВОРОТКИ. Разведение 1: 10 это 1 мл сыворотки + 9 мл физ. раствора 1: 50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или 1: 50 это 0, 1 мл сыворотки + 4, 9 мл физ. раствора 1: 100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или 1: 100 это 0, 1 мл сыворотки +9, 9 мл физ. раствора. v В 10 пробирок вносим по 2, 5 мл физиологического раствора. 8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль сыворотки и контроль антигена. v В контроль сыворотки вносим только разведенную сыворотку в объеме 2, 5 мл, в контроль антигена только взвесь диагностикума.

УЧЕТ РЕАКЦИИ v Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси диагностикума. v В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках просветляется, на дно оседает осадок агглютината. v Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена равномерно мутная взвесь диагностикума. v Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно видно формирование осадка агглютината.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ) Ингредиенты Содержимое пробирок Контроль Сыворотки Физиологический раствор 0, 85 Антигена 0, 5 - 0, 5 в 0, 5 0, 5 % хлорида натрия, мл Сыворотка разведении 1: 50 мл Разведения Диагностикум, (1: 50) 1: 100 1 2 2 к 1: 200 1: 400 1: 800 - 2 к 2 к 2 к - 2 к млрд. микробных тел В термостат при +37 С° на 2 часа, затем на 18 20 часов при в 1 мл. комнатной температуре

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ ОТЛИЧАЕТСЯ ОТ АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ХАРАКТЕРУ АНТИГЕНОВ: q В реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. q Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества. q Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. q За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

ФЕНОМЕН ПРЕЦИПИТАЦИИ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЕТСЯ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ: q В судебно медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. q Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). q Реакцию Ухтерлони используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. q Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

РЕАКЦИЯ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ НА ПРИМЕРЕ ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА (ЭДС). q Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых обследованиях на сифилис. q В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов, антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический). Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета. Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген (контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата). q В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении 1: 10 и кардиолипиновый антиген. q После смешивания реагентов в течение 2 5 минут осторожно покачиваем планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в лунке становится прозрачной. q Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат, оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4 ++++ положительным. Схема реакции микропреципитации представлена на рис. 10.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (РЕАКЦИЯ МАНЧИНИ) Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агара с раствором антигена образуют линии и полосы преципитации. q Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. q Взаимное рас положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. q Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. q Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак ты различных органов и т. д.

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ q Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. q Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. q В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1 2 часов. q Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. q Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5 7 суток в геле образуются зоны преципитации. q Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).

РЕАКЦИЯ БАКТЕРИОЛИЗА q применяется редко, она используется для дифференциальной диагностики холерного вибриона от других холероподобных бактерий. q В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с бактериями, q что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису бактерий.

В РЕАКЦИИ ГЕМОЛИЗА q антигеном служат эритроциты, антителом – антигемолитические антитела. q При образовании комплекса антиген антитело начинается активация комплемента, в результате чего мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко красную прозрачную жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода гемоглобина. q При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА И СВЯЗЫВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА. q Необходимые антиген, антитело и комплемент. q Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. q Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. q В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: q против бактерий бактериолизины, спирохетолизины, эритроцитов гемолизины, против других клеток цитолизины. q Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. q Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК). q При образовании комплекса антиген антитело к нему всегда присоединяется комплемент. q Если антиген и антитело не отвечают другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. q При добавлении комплекса эритроциты барана гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. q Этот принцип и положено в основу РСК. q При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. q При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза реакция негативная.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК). Опытная система АНТИГЕН (Бактерия, клетка, вирус и т. д.) КОМПЛЕМЕНТ АНТИТЕЛО (сыворотка) Комплемент связался с комплексом антиген-антитело Индикаторная гемолитиче ская система ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНА (АНТИГЕН) ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СЫВОРОТКА (АНТИТЕЛО) Комплемента нет - связался с опытной системой. Без комплемента гемолиз эритроцитов невозможен.

Критерии учета результатов реакции + + Полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная РСК. + + + Неполная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета; положительная РСК. + + Частичная задержка гемолиза, надосадочная жидкость красно розового цвета, прозрачная; слабо положительная РСК. + Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная РСК. Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная РСК.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИРЕЗУС - АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКЕ. q Данная реакция проводится у беременных женщин, имеющих отрицательный резус фактор. q В случае, если у отца ребенка положительный резус фактор, то у плода возможен как положительный, так и отрицательный резус. q Для предотвращения резус конфликта необходимо знать, образуются ли антирезус антитела в течение беременности q и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их титра.

ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДАННОЙ РЕАКЦИИ НЕОБХОДИМЫ СЛЕДУЮЩИЕ ИНГРЕДИЕНТЫ q Исследуемая сыворотка q Эритроциты человека, несущие положительный резус фактор (стандартные эритроциты) q Комплемент. q Этапы постановки теста: q В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки q В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных эритроцитов q Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе. q В качестве положительного контроля используем сыворотку, имеющую антирезус антитела; в качестве отрицательного контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА ВЕДЕТСЯ ПО ГЕМОЛИЗУ: q В пробирке с отрицательным контролем наблюдаем осадок эритроцитов q В пробирке с положительным контролем – полный гемолиз, то есть q равномерно окрашенная в красный цвет жидкость q В исследуемых образцах при наличии антирезус антител – полный гемолиз, при их отсутствии – осадок эритроцитов.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ q Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) воз будителя и титра вируснейтрализующих антител. q Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответст вующим вирусом с последующим введением этой смеси воспри имчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. q На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором су дят о нейтрализующей активности сыворотки.

РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РТГА) q q Основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА ши роко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (анти генам).

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ q Участвуют меченые антигены или антитела. q К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, q ра диоиммунный q иммуноферментный методы. q По своей чувстви тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ПО КУНСУ) МЕТОД ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКИ, q Для выявления микробных антигенов в тканях использовали меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (ва риантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов). q Метку антител производят флюорохромами(изотиоцианат флюоресцеина)

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА q включает использование коммерческих реагентов – антигенов или антител, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). q Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках фиксирован антиген или антитело. q После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды. q В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом в специфической фазе, q а не анализировать вторичные проявления взаимодействия – агглютинацию, преципитацию или гемолиз. q Метод отличает высокая чувствительность – обычно достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

ЭТАПЫ ВЫПОЛНЕНИЯ РЕАКЦИИ (НА ПРИМЕРЕ ДИАГНОСТИКИ АНТИТЕЛ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ): q В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо отрицательной q Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут q Промываем лунки планшета фосфатно солевым буфером 5 раз q Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом q Промываем лунки фосфатно солевым буфером 5 раз q Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и бензидин q Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте q Проводим визуальный учет результатов и определение оптической плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА q При правильной постановке анализа в лунке, содержащей положительную контрольную сыворотку, меняется цвет он становится желтым. q В отрицательном контроле цвет прозрачный. q Учет результатов опытных образцов зависит от изменения цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в положительном контроле, значит, у данного пациента обнаружены антитела к ВИЧ.

УПРОЩЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИФА «БЕЗРЕАГЕНТНЫЕ» СИСТЕМЫ q Для проведения анали за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед ствие образования продукта ферментативной реакции. q Преимущества: q не используются радиоактивные изотопы, q стабиль ность онъюгатов позволяет хранить их в течение к длительного времени, q измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, q результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). q ИФА очень легко под дается автоматизации.

РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (РИА) q Преимущество РИА: отсутствует необ ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро цитов. q 2 варианта: q меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе цифическими антителами. q Для того чтобы происходило конку рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. q После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном q количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе мой пробе. .

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ: Основные А. §. Коротяев А. И. , Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С-П. , 2000. § Медицинская микробиология. / Под ред. В. И. Покровского. М. , 2001. § Л. Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М. , 2001 § Медицинская микробиология, вирусология /Под ред. А. А. Воробьева. М. 2004.

Иммунитет – это способ защиты организма от чужеродных тел и веществ, являющихся носителем инородной информации.

Функция иммунной системы связана с распознаванием «своего» (молекулы собственного организма) и «чужого». Эта система ответственна за инактивацию чужеродных веществ и молекул, обозначаемых термином антигены .

Антигены бывают 2-х видов:

1. Растворимые (белки, полисахариды, нуклеопротеины);

2. Нерастворимые (бактерии, простейшие, опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом).

При этом клетки иммунной системы распознают не весь антиген, а небольшой молекулярный домен, известный как антигенная детерминанта или эпитоп .

Реакции, разыгрывающиеся в организме в ответ на поступление антигена, условно делят на два вида:

1 реакции клеточного типа ;

2. реакции гуморального типа .

Эти реакции осуществляются иммунокомпетентными клетками. При этом реакция гуморального иммунитета направлена против растворимых антигенов. Она завершается образованием антител, то есть высокомолекулярных веществ инактивирующих этот антиген.

Реакция клеточного иммунитета разыгрывается в ответ на поступление нерастворимого антигена и завершается образованием цитотоксических клеток или Т-лимфоцитов киллеров.

Для заметок:

Классификация иммунокомпетентных клеток

Это обширная группа, включающая Т- и В-лимфоциты, макрофаги, тучные клетки, основана на функции этих клеток и делит их на следующие группы:

1. Антигенпрезентирующие клетки (АПК);

2. Эффекторные клетки;

3. Вспомогательные клетки;

4. Регуляторные клетки;

5. Клетки иммунологической памяти.

Антигенпрезентирующие клетки – это система клеток, передающих информацию об антигене Т- и В-лимфоцитам. К ним относятся макрофаги и моноциты, дендритные клетки лимфоидных фолликулов, отдельные субпопуляции В-лимфоцитов и М-клетки пейеровых бляшек.

Эффекторные клетки – это цитотоксические Т-лимфоциты и плазматические клетки. Иногда к этой группе относят и NK-клетки.

Вспомогательные клетки иммуногенеза – включают гранулоциты, тучные клетки (тканевые базофилы), натуральные киллеры (NK-клетки);

Регуляторные клетки – к ним относятся Т-хелперы (Тх), Т-супрессоры и В-супрессоры. В качестве регуляторных клеток иммунных реакций могут выступать моноциты, макрофаги, гранулоциты и тучные клетки.

Клетки иммунологической памяти – это клетки сохраняющие память об антигене после его первого попадания в организм. К ним относят: Т- и В-лимфоциты памяти (долгоживущие лимфоциты), а также интердигитирующие клетки и фолликулярные дендритные клетки.

Основными клетками иммунных реакций являются лимфоциты , которые как известно делятся на Т- и В-лимфоциты. В основу их обозначения положено место их дифференцировки: для В-лимфоцита – красный костный мозг , а для Т-лимфоцитов – тимус . Процесс дифференцировки этих клеток в названных органах получает название антигеннезависимой дифференцировки или соответственно В- и Т-лимфоцитопоэз .

Для заметок:

В-лимфоцитопоэз

Происходит в зоне красного костного мозга по следующей схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-В-лимфоцит (лимфобласт) → незрелый В-лимфоцит (про-лимфоцит) → зрелый В-лимфоцит (малый лимфоцит)

Образующиеся зрелые лимфоциты подразделяются на множество клонов (порядка 10 9), различающихся антигенной специфичностью своих Ig-рецепторов. При этом В-клетки одного клона имеют на поверхности Ig-белок лишь одной иммуноспецифичности. Эти рецепторы образуются в результате перестройки той области генома, которая кодирует полипептидные фрагменты иммуноглобулинов.

Т-лимфоцитопоэз

(Антигеннезависимая дифференцировка)

Происходит по схеме:

СКК → КОЕ-Л → унипотентный предшественник → пре-Т-лимфоцит (лимфобласт) → про-Т-лимфоцит (пролимфоцит) → зрелый Т-лимфоцит (малый лимфоцит)

Эта дифференцировка Т-лимфоцитов происходит в тимусе и заканчивается образованием на поверхности Т-клеток – ТCR-рецепторов. Клетки проходят через стадию положительной селекции и на поверхности Т-лимфоцита (стадия пре-Т-клетка) появляются два белка, по которым различают Т-киллеров и Т-хелперов – это CD4 и CD8. Дальнейшая дифференцировка связана с сохранением у Т-лимфоцитов только одного белка соответственно CD4 или CD8.

Иммунологическая реакция гуморального типа

Это последовательные стадии реакции В-лимфоцита на растворимый антиген, антигензависимая дифференцировка. Первая фаза определяется как стадия распознавания антигена антигенпрезентирующей клеткой (АПК).

I фаза

(Стадия распознавания антигена)

1. Эндоцитоз антигена АПК;

2. Процессинг антигена, то есть частичное расщепление антигенных молекул с сохранением высокоиммуных антигенных детерминант, имеющих вид линейных пептидных цепочек, длинной от 8 до 11 аминокислот.

3. Формирование комплекса эпитоп с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС) и появление его на поверхности АПК;

4. Презентация комплекса (эпитоп + МНС 2 класса) на поверхности АПК;

5. Секреция АПК интерлейкина 1.

Главным действующим комплексом в этой схеме распознавания антигена является АПК , которая обладает способностью к синтезу МНС 2 класса. Эти молекулы синтезируются в зоне гранулярной ЭПС, но не в свободном виде, а в виде комплекса с инвариантной пептидной цепью, функция которой связана с транспортом МНС внутри АПК. Именно она направляет молекулу МНС к эндосоме, содержащей эпитоп , при этом пузырёк с МНС сливается с эндосомой и комплекс МНС-эпитоп появляется на поверхности АПК.

Итак, МНС 2 класса имеются только у «профессиональных» АПК, все остальные клетки обнаруживают на своей поверхности молекулы МНС 1 класса, что позволяет распознавание этих клеток цитотоксическими лимфоцитами. См. рис. 36

Рис. 36: Схема иммунологической гуморального типа

II фаза

Она связана с активацией Т-лимфоцита хелпера (Тх) комплекосм МНС 2 класса с антигеном, находящимся на поверхности АПК. Активация Тх завершается выделением лимфокинов, которые регулируют деятельность Т- и В-лимфоцитов. При этом в условиях развития гуморального иммунитета происходит выделение ИЛ - 4, - 5, -6, - 9, -10. Интерлейкины активируют В-лимфоциты, которые вступают в стадию клональной пролиферации, а затем и дифференцировку в плазматические клетки.

III фаза

Эта выработка плазматической клеткой , образовавшийся из В-лимфоцитов после стимуляции его антигенами Т-хелпером/индуктором, антител (иммуноглобулинов). Выделяемые антитела инактивируют антиген, при этом антитела характеризуются специфичностью к антигенам и связываются только с тем антигеном, на который они выработались.

Различают несколько классов иммуноглобулинов: Ig G (75% в сыворотке крови), Ig M (10%), Ig A (10%), Ig E (0,004%), Ig D (1%). Основу структурного разнообразия антител определяет последовательность аминокислот в вариабельных областях тяжёлых и лёгких цепей.

Для заметок:

Иммунологическая реакция клеточного типа

I фаза

(Стадия распознавание антигена)

В первую свою фазу, то есть фазу распознавания антигена сохраняется схема, описанная для гуморальной иммунологической реакции. Она также заканчивается появлением на поверхности АПК молекулы МНС 1 класса и эпитопа.

При этом молекулы МНС 1 класса располагаются на поверхности всех клеток, что позволяет цитотоксическим Т-лимфоцитам узнавать, а затем и уничтожать опухолевые клетки или клетки, заражённые вирусом.

II фаза

(Активация Т-лимфоцитов)

Началом этой фазы являются два сигнала, подаваемые Т-лимфоциту хелперу:

1. Комплекс эпитопа антигена с молекулой МНС 1 класса. Этот комплекс распознаётся с помощью ТСR и CD8.

2. Синтез интерлейкинов или их комбинаций. См. рис. 37

Тх 1 выделяет ИЛ-2 и интерферон, а также экспрессирует на своей поверхности рецепторы к ИЛ-2. Активация Т-лимфоцита, при отсутствии на поверхности клетки «своего» антигена МНС-1 приводит их к бласттрансформации и образуется субпопуляция иммунокомпетентных Т-лимфоцитов или Т-киллеров.

Рис. 37: Схема иммунологической реакции клеточного типа

III фаза

(Взаимодействие Т-киллера с клеткой-мишенью)

1. Контакт Т-киллера с клеткой мишенью;

2. Увеличение в Т-лимфоците концентрации ионов Са 2+ ;

3. Экзоцитоз гранул перфорина в межклеточное пространство;