NS-3500 представляет собой высокоскоростной конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) для проведения высокоточных и надежных трехмерных измерений топографии поверхности. Получение конфокального микроскопического изображения в реальном времени достигается за счет использования быстрых сканирующих оптических модулей и алгоритмов обработки данных.

Данная система является перспективным решением для измерения и проверки трехмерных микроскопических структур, таких как полупроводниковые подложки, FPD панели, MEMS устройства, стеклянные подложки и просто различные поверхности. Микроскоп NS-3500 позволяет проводить измерения в различных областях (область сканирования размером до 10 × 10 мм) образцов с размерами до 150×150 мм за счет большого диапазона перемещения предметного столика. Также имеется опциональная возможность расширения платформы до 200×200 мм.

При необходимости измерения различных точек/областей более габаритных образцов доступна модификация измерительной головки промышленного типа (см. NS-3800).

• Неразрушающий оптический 3D-контроль с высоким разрешением
• Получение конфокального изображения в реальном времени
• Различное оптическое увеличение для наблюдаемой области
• Одновременная конфокальная микроскопия и микроскопия белого света
• Автоматический поиск усиления для тонкой фокусировки
• Компенсация наклона
• Простота анализа полученных данных
• Высокоточное и высокоскоростное измерение высоты
• Возможность качественного анализа толщины полупрозрачных материалов
• Отсутствие пробоподготовки
• Режим двойного сканирования вдоль вертикальной оси Z
• Сшивание изображений для анализа больших областей

Области применения

Лазерный сканирующий микроскоп NS-3500 является идеальным решением для измерения высоты, ширины, глубины, углов, площади, а также объемной визуализации микроструктур, таких как:

• Полупроводники - IC подложки, высота выступов/ступеней и проволочных петлей, анализ дефектов, CPM процессы (химико-механическая планаризация)
• Плоскопанельные дисплеи (FPD) - анализ сенсорных панелей, ITO подложек, высота разделительной колонны в ЖК-дисплее
• МЭМС устройства - трехмерный профиль структуры, шероховатость поверхности, подложки
• Стеклянные поверхности - тонкопленочные солнечные элементы, текстура солнечного элемента, анализ рисунка после лазерного воздействия
• Исследование материалов - анализ опорных поверхностей зажимного устройства, шероховатости и сколов

Программное обеспечение NSWorks & NSViewer

• Простое и интуитивное управление даже для новых пользователей
• ПЗС изображение, конфокальное изображение, а также основная панель управления одновременно отображаются на одном экране
• Разные параметры настройки предназначены для передовых приложений
• Построение конфокального изображения в режиме реального времени обеспечивает немедленную обратную связь с оборудованием
• Отдельное окно анализа с удобными графическими инструментами для создания отчетности
• Объемный графический вид позволяет пользователю легко распознать микроскопическую структуру образца

Сшивание изображения

При необходимости анализа большой области сканирования (до 15×15 мм макс.) доступно последовательное поточечное измерение мелких областей с их последующим сшиванием. Данная особенность реализована за счет использования моторизированного предметного столика и программной утилиты NSMosaic. После сшивания полученное изображения может быть проанализировано как единое целое со всеми доступными функциями из NSViewer.

Видео-обзор: Сшивание изображений на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе NS-3500

Примеры измерений с помощью NS-3500

Измерение высоты стандарта VLSI	Анализ выступающей части на OLED	Анализ результатов лазерной обработки OLED
Кварцевая подложка	Поверхность бриллианта	Дефект на металлическом зеркале
Неровность на выпуклой поверхности	Графен	Подложка оксида индия и олова
Анализ структуры микролинзы	Анализ узкой области подложки	Вид исследуемого образца при различном оптическом увеличении
Постобработка изображения профиля поперечного сечения	Сшивание изображения при анализе монеты	Анализ профиля поверхности капли воды

Вновь сконструированный многопараметрический микроскоп фирмы Leitz позволяет проводить одновременно анализ поглощения гемоглобина эритроцитов и флуоресценции меченных ФИТЦ клеток, содержащих гемоглобин S, причем можно анализировать миллионы клеток. Система (LEYTAS), соединенная с анализирующим изображение компьютером, сначала фокусируется и считает все эритроциты вдоль одного ряда полей зрения, используя нижнее освещение фиолетовым светом (415 нм). После сканирования по одной линии длиной 8 см освещение по команде компьютера меняется с проходящего на падающее, и все поля зрения вдоль линии сканирования анализируются повторно, причем сканирование для определения флуоресцирующих объектов ведется в соответствии с кривой ранее определенных положений фокуса. Для каждого определенного объекта его флуоресцентное и поглощающее изображение хранятся в памяти в виде уровней серого. Из памяти изображение выводится на телевизионный экран, что позволяет визуально оценить выбранные объекты (рис. 6.9). От каждого подозрительного сигнала в памяти сохраняется одно флуоресцентное и два поглощающих изображения. Визуальное сравнение флуоресцентного и поглощающего изображений при большом увеличении позволяет определить природу данного сигнала. Таким образом артефакты можно отличить от заслуживающих внимания клеток. То, что сигнал действительно соответствует мутантной клетке, подтверждается с помощью микроскопа. Поскольку все координаты сохраняются в памяти, то выставление клеток производится автоматически. Большинство сигналов являются артефактами. На рис. 6.9 только кадр № 79 относится, вероятно, к мутантной клетке , что можно было бы подтвердить с помощью микроскопа.

Рис. 6.9. Выявление с помощью системы LEYTAS подозрительных изображений в препарате, окрашенном меченной ФИТЦ сывороткой против S-гемоглобина. Эти изображения выводятся на монитор. Слева направо: номер кадра, его флуоресцентное изображение и изображение того же кадра, формирующееся за счет поглощения при большем увеличении

Другие антитела против мутантных эритроцитов были использованы Лэнглойсом с соавт. , определявшими мутантные клетки с помощью проточной цитометрии. Можно предположить, что частота выявленных в этой работе мутантов была значительно выше, чем частота встречаемости клеток с HbS.

Помимо определения редких мутантов, анализ изображения может быть также применен для определения редких раковых клеток в период ремиссии, а также инфицированных вирусом клеток на ранней стадии инфекционного заболевания.

7. Сканирующая лазерная микроскопия

Обычно в микроскопии изображения очень мелких структур получают путем освещения всего препарата и увеличения изображения объективом. При использовании вместе с микроскопом телевизионной камеры принцип получения изображения не изменяется - изображение также создается объектом, и лишь затем сканируется телекамерой. Фактически все методы сканирования применялись в основном в весьма ограниченной области микрофотометрии - для определения величин поглощения, флуоресценции или отражения. Недавно техника сканирования была применена для создания высококачественных изображений с помощью мощных и хорошо сколлимированных лазерных пучков. В оптической лазерной сканирующей микроскопии объект не освещается целиком, а сканируется шаг за шагом . В каждой освещенной точке измеряется прошедший, отраженный или испускаемый свет. Изображение создается за счет накопления результатов этих измерений для каждой точки после их аналоговой или цифровой обработки, как матрица в памяти компьютера.

В приборе, имеющемся в нашей лаборатории (Zeiss, ФРГ), сканирование выполняется с помощью гальванометров с сервоприводами. Время сканирования сравнительно короткое (2 с на поле из 512x512 пикселов). Процесс сканирования контролируется микропроцессором. В качестве фотодетектора используется ФЭУ. Его сигнал проходит через блок аналоговой обработки, который контролирует яркость и контрастность.

После оцифровки этот сигнал попадает в буферную память, куда он записывается с видеочастотой. Соответственно стационарное изображение на мониторе получается при условии, что во время считывания столик стоит неподвижно. Плавно меняющееся увеличение может быть получено с помощью блока переменного увеличения. Сканирующий лазерный микроскоп можно использовать как с обычным, так и с лазерным источником света. С помощью лазера можно получить как падающее освещение (для отражения и флуоресценции), так и проходящее освещение (для поглощения, фазового или дифференциального интерференционного контраста). В качестве обычного источника света можно использовать только лампу накаливания, снабженную световодом. Для обеспечения лучшей фокусировки и возможностей поиска на препарате, а также для исследования препаратов с двойным окрашиванием, мы добавили к лазерному сканнеру обычный блок эпиосвещения. Принципиальными преимуществами лазерного сканирования являются:

1) низкий уровень аутофлуоресценции в оптическом пути, который достигается благодаря точечному освещению;

2) высокая чувствительность микроскопа, возникающая вследствие использования мощного лазерного света, сфокусированного в точке. Можно наблюдать даже слабо флуоресцирующие ДНК-зонды;

3) использование оптики с малым увеличением. Интенсивность флуоресценции достаточно высока, что позволяет работать с объективом Х2,5. Это является важным преимуществом при проведении исследований мозга;

4) низкий уровень выцветания, так как время освещения каждой точки очень короткое;

5) возможность проведения многофакторного анализа;

6) последовательное сканирование на разных уровнях при конфокальной сканирующей микроскопии. Данный метод применяется в тех исследованиях, где надо работать с очень слабой флуоресценцией,

например при проведении реакции гибридизации. Лазерная сканирующая микроскопия много дала также для исследований мозга, поскольку она позволяет использовать оптику с малым увеличением, необходимую при исследовании связей в нервных сетях. На рис. 6.10 представлены нервные клетки из гиппокампа крысы. Эти клетки были маркированы для выявления специфических молекул. По сравнению с нормальной флуоресцентной микроскопией контраст между изображением и фоном, получаемый с помощью лазерного сканирования, намного выше: здесь остается только очень низкий уровень нежелательного фонового свечения. С помощью лазерного сканирования реакцию можно также оценить количественно, поскольку данная техника позволяет установить порог между клетками и фоном для улучшения контраста изображения, получаемого с препаратов с очень низким содержанием продукта реакции.

Кроме того, лазерное сканирование открывает новые возможности для исследования с помощью световой микроскопии без дополнительного окрашивания ультратонких срезов, изготовленных для электронной микроскопии .

Рис. 6.10. Флуоресцентное изображение гиппокампа крысы, полученное с помощью лазерного сканирующего микроскопа. Срезы были обработаны флуоресцентно меченными антителами к гуанинмонофосфату. Увеличение: объектив Х40; окуляр ХЮ. Шкала 100 мкм.

8. Литература

1. Yong, M. R. (1961) Quart. J. Microsc. Sci., 102, 419.

2. Price, Z. H. (1965) Am. J. Med. Technol., 31, 45.

3. Rost, F. W. (1972) In Histochemistry, Theoretical and Applied. Everson Pearse, A. G (ed.), Churchill Livingstone, Edinburgh, Vol. 2, p. 1171,

4. Siegel, J. I. (1982) Int. Lab., 12, 46.

5. Ploem, J. S. and Tanke, H. (1987) Introduction to Fluorescence Microscopy. Royal Microscopical Society, University Press, Oxford.

6. Lansing Taylor, D., Waggoner, A. S., Murphy, R. F., Lanni, F. and Birge, R. R. (1986) Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences. Alan Liss, New York.

7 Patzett, W. (1972) Lietz-Mitt. Wiss. und Techn., Bd V, Nr 7, 226.

8 Giloh, H. and Sedat, J. W. (1982) Science, 217, 1252.

9 Johnson, G. D. and de C. Nogueira Araujo, G. M. (1981) J. Immunol. Methods, 43, 349.

10 Ploem, J. S. (1967) Zeitschrift Wiss. Microskopie, 68, 129.

11 Nairn R. С (1976) Fluorescent Protein Tracing. Livingstone, Edinburgh.

12. Kraft, W. (1973) Leitz Techn. Inform., 2, 97.

Антони ван Левенгука чаще других называют изобретателем микроскопа. С исторической точки зрения это не совсем верно: задолго до него и знаменитый Галилей, и отец и сын Янсены, и Корнелиус Дреббель представили публике свои оптические приборы. Однако слава Левенгука вовсе не беспочвенна: именно ему впервые удалось рассмотреть одноклеточные организмы, клетки крови, строение глаз насекомых — то есть действительно выйти на микроуровень.

Заставить каплю повиснуть и не упасть — самая сложная задача. Для этого подойдет карандаш или корпус от шариковой ручки. Стоит поэкспериментировать с углами наклона и количеством воды.

Вопреки распространенному представлению, микроскоп Левенгука совсем не был похож на современный. Он представлял собой одну-единственную линзу, зажатую в специальном штативе. Человек несведущий скорее назвал бы этот прибор лупой.

Попасть лазером в каплю воды не так-то просто. Возможность надежно закрепить указку очень важна. Мы использовали кронштейны для пайки из радиомагазина.

Капля воды — это та же линза. Взгляните на определение: линза — это деталь из прозрачного однородного материала, ограниченная двумя полированными преломляющими поверхностями вращения (сферическими поверхностями). Капля имеет форму сферы, вода однородна, поверхностное натяжение работает на ней лучше всякой полировки, и, наконец, коэффициент преломления воды не равен таковому у воздуха. А значит, капля — это линза, хотя и не очень хорошая.

Площадь изображения на экране многократно превышает сечение лазерного луча. Поэтому, чтобы изображение было ярким, стоит раздобыть мощную лазерную указку с зеленым лучом.

Если направить на каплю луч лазерной указки и спроецировать его на белый лист бумаги, мы увидим, что происходит внутри капли. Лазер дает когерентное (образно говоря, параллельное) излучение, поэтому можно сказать, что его луч изначально идеально сфокусирован. Теоретически можно было бы использовать и обычную лампу, но для точной фокусировки ее света в капле понадобилась бы куда более сложная оптическая система. Не стоит обольщаться: это неплохой опыт по оптике, но не по биологии. Коэффициент увеличения капли невелик, поэтому объекты, которые вы увидите на экране, — это вовсе не микроорганизмы, а просто частицы пыли или мелкие волоски. Эффект движения создается за счет перемешивания воды внутри капли. И все же в зрелищности опыту не откажешь.

Конфокальная микроскопия – это один из методов оптической микроскопии, который обладает существенным контрастом по сравнению с обычными классическими микроскопами. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света.

В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной токи объекта. Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки оптической системы. После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.

Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С его помощью можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.

Описание метода конфокальной микроскопии

Благодаря конфокальной флуоресцентной микроскопии появилась возможность получать трехмерное субмикронное расширение объектов, а также значительно расширилась возможность проведения неразрушающего анализа прозрачных образцов. Благодаря использованию в указанных микроскопах в качестве источников света лазеров, достигается повышение их разрешающей способности.

По сравнению с ксеновыми или ртутными лампами лазеры отличаются существенными преимуществами, так как обладают способностью монохроматичности, а также высокой параллельности испускаемого пучка света. Такие свойства лазерного излучения обеспечивают оптической системе более эффективную работу, а также снижают количество бликов и увеличивают точность фокусировки пучка света.

На исследуемом образце лазер освещает не все поле зрения, а фокусируется в определенной точке. Конфокальная диафрагма позволяет избавиться от внефокусной флуоресценции, при этом изменяя диаметр диафрагмы, можно точно определять толщину оптического слоя возле фокуса лазерного луча. Благодаря описанному свойству конфокальная микроскопия позволяет получать улучшенное разрешение вдоль оси Z.

Специальные программы, которыми оснащены конфокальные микроскопы, позволяют из серии оптических срезов создавать объемные изображения объектов, а также рассматривать их под разными углами зрения.

Применение мультиспектрального лазерного сканирующего конфокального микроскопа дает возможность изучать колоколизацию в клетке различных веществ. Мультиспектральный режим позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования по методу FISH.

Примеры исследований, проводимых с помощью конфокального микроскопа

Конфокальная микроскопия помогает изучать способность различных веществ накапливаться в ядре, цитоплазме или в других клеточных структурах. Эти способности зачастую применяются в процессе проведения исследований механизмов действия канцерогенов, противоопухолевых соединений, лекарственных препаратов, а также позволяют рассчитывать их эффективные концентрации.

Летальное изучение интенсивности, а также формы спектров собственной флуоресценции дает возможность распознавать воспаленные и нормальные клетки. Этот метод используется на ранних сроках диагностики рака шейки матки.

Правильно подобранная комбинация различных фильтров, предназначенных для нескольких типов собственной флуоресценции, может получаться без трудоемкого исследования множества срезов. Таким образом, можно быстро и точно обнаруживать злокачественные тканевые структуры и отличать их от нормальных.

Методы конфокальной микроскопии достаточно широко используются в гидробиологии и эмбриологии, в ботанике и зоологии в процессе изучения структуры гамет, а также развития и формирования организмов.

Конфокальные лазерные микроскопы в современном мире нашли широкое применение в области биологии, биофизики, медицины, клеточной, а также молекулярной биологии. Конфокальная микроскопия – это уникальная бесконтактная методика, которая сегодня используется для изучения роговицы глаза. Она позволяет максимально точно оценить имеющуюся степень клеточных изменений и внеклеточных структур, а также сделать выводы о возможном повреждении роговицы в целом.

Лазерные конфокальные микроскопы обладают высоким разрешением, поэтому позволяют исследовать структуру флуоресцентно меченых клеток и даже отдельных генов. Применение всевозможных технологий специфической многоцветной флуоресцентной окраски для биологически активных молекул, а также надмолекулярных комплексов дает возможность изучать сложные механизмы функционирования не только отдельных клеток, но и целых систем. Данная технология широко используется в экспериментальной биологии, а также в медицине.

Оборудование - конфокальные микроскопы

Современные сверхточные конфокальные микроскопы, такие как Leica TCS SP8 позволяют получить максимально четкие и достоверные данные при проведении различных исследований. Широкий интерес к таким приборам возник в восьмидесятых годах прошлого столетия, из-за быстрого развития компьютерной техники и лазерных технологий.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия представляет собой разновидность оптической микроскопии. Ее особенностью является то, что лазерный луч фокусируется на определенную область по осям Х и У и формирует, таким образом, изображение. Отраженный свет демонстрируется на экране в виде растра. Размеры изображения напрямую зависят от разрешающей способности современной электроники, а также от размеров сканируемого растра.

Измерительные приборы, которые созданы с помощью современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, в наше время получили широчайшее распространение в разных сферах. По сравнению с обычной световой микроскопией конфокальная микроскопия обладает следующими преимуществами:

• улучшенная разрешающая способность;
• высокая контрастность изображения;
• возможность проводить мультиспектральные исследования с высокой степенью разделения сигналов;
• возможность получения «оптических срезов» с трехмерной реконструкцией;
• возможности использования способов цифровой обработки полученных изображений;

Из недостатков описанной аппаратуры можно выделить:

• сложность настройки прибора;
• отсутствие оптического изображения;
• высокая стоимость приборов, также дороговизна их обслуживания.

В конфокальном микроскопе для управления всей системой используется специальный компьютер. Он позволяет сохранять изображения и детально изучать полученные данные. Для качественной обработки полученных изображений зачастую требуются достаточно большие вычислительные мощности, поэтому компьютер должен обладать довольно большой оперативной памятью. Для дальнейшего хранения информации требуется также и большая дисковая память. Для передачи изображений такой компьютер должен иметь USB-порт или CD/DVDRW. Также компьютер имеет возможность подключения к глобальной интернет или локальной сети.

Программное обеспечение, установленное в таких компьютерах, может быть базовым. Оно поставляется вместе с техникой и позволяет управлять всей системой и контролировать ее основные функции. Также для указанных компьютеров специально разрабатываются пакеты прикладных задач, которые заказываются дополнительно. Многие модели конфокальных микроскопов имеют специальный пульт управления, позволяющий настраивать их работу дистанционно.

Устанавливают описанные приборы в обычных лабораторных посещениях. Важнейшей процедурой в процессе эксплуатации конфокальных микроскопов является контроль за вибрациями. Для таких целей применяют специальное устройство, измеряющее уровень вибрации. Процедура контроля похожа на процедуру измерения аксиальной разрешающей способности ЛСКМ при помощи зеркала.

Конфокальная микроскопия стремительно развивается. Известные компании-производители представляют на рынке новейшие образцы конфокальных микроскопов, которые позволяют эффективно разделять лазерный луч возбуждения, а также люминесценцию. С помощью компьютера в таких приборах управляется светоделитель. Его спектральные свойства при необходимости могут достаточно быстро перестраиваться на несколько лазерных линий.

Конфокальные микроскопы в микробиологии

Конфокальный микроскоп также незаменим в биологии для детального исследования клетки. Сегодня на эту тему публикуется огромное количество различных научных статей. Чаще всего при помощи конфокальных микроскопов изучают структуру клеток, а также их органоидов. Также исследуется колокализация в клетке для того, чтобы понять есть ли причинно-следственная связь между веществами клетки.

В процессе изучения белков конфокальными микросокпами они предварительно маркируются антителами с разными флуорохромами. С помощью обычного классического микроскопа довольно трудно разобрать расположены ли они рядом либо же один под другим, а вот конфокальный микроскоп позволяет это сделать без особых проблем. В памяти компьютера записываются данные о серии оптических срезов и, таким образом, проводится объемная реконструкция объекта, атакже получается его трехмерное изображение.

Также с помощью конфокальных микроскопов исследуют динамическое процессы, протекающие в живых клетках, например, передвижение ионов кальция или других веществ сквозь клеточные мембраны. Используют конфокальные микроскопы и для изучения подвижности биоорганических молекул с помощью ионизации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения, а также последующего его рассоединения с молекулами. Такие молекулы маркируются двумя флуорохромами, обладающими спектром испускания донора, который перекрывается спектром поглощения акцептора. Таким образом, энергия передается от донора к акцептору на небольших расстояниях и в результате резонанса между энергетическими уровнями. После этого акцептор в видимой области спектра излучает энергию, которая впоследствии регистрируется с помощью конфокального микроскопа.

Развитие конфокальной микроскопии продолжается. Компании-производители указанного оборудования ежегодно представляют на рынке все более современные, функциональные и усовершенствованные микроскопы, позволяющие ученым совершать новые полезные открытия в самых разных сферах. Совершенствуется и программное обеспечение, предназначенное для компьютеров, которыми оснащены конфокальные микроскопы. Оно позволяет воплощать в жизнь самые сложные задачи, которые дают возможность проводить исследования на молекулярном и клеточном уровне. Сегодня с уверенностью можно сказать, что за конфокальными микроскопами будущее, так как по своим функциональным характеристикам и техническим возможностям они существенно превзошли обычные микроскопы. Среди достаточно широкого ассортимента конфокальной оптической аппаратуры каждый пользователь сможет подобрать для себя именно торт микроскоп, который позволит ему активно развивать свои исследования.

Двухфотонный микроскоп является разновидностью мультифотонного флуоресцентного микроскопа . Его преимущества по сравнению с конфокальным микроскопом - большая проникающая способность и низкая степень фототоксичности .

Двухфотонный микроскоп был впервые сконструирован Винфредом Денком в лаборатории В. В. Вебба в Корнеллском университете . Он скомбинировал идею двухфотонного возбуждения с лазерным сканированием.

Процесс двухфотонного возбуждения происходит следующим образом: два фотона , обладающие низкой энергией, возбуждают флюорофор (способную к флюоресценции молекулу или часть молекулы) в течение одного квантового события. Результатом этого возбуждения является последующее испускание возбужденными молекулами флюоресцентного фотона. Энергия флуоресцентного фотона больше энергии возбуждающих фотонов.

Вероятность того, что оба фотона возбуждения будут поглощены одной молекулой, очень мала. Поэтому необходим большой поток возбуждающих фотонов, который можно получить при помощи лазера, испускающего фотоны с большой частотой следования импульсов (80 МГц). Наиболее часто используемые флюорофоры имеют спектр возбуждения в промежутке 400-500 нм, в то время как длина волны возбуждающего лазера находится в промежутке 700-1000 нм (область инфракрасных волн). Если флюорофор поглотит одновременно два фотона, то он получит достаточно энергии, чтобы перейти в возбужденное состояние. Далее возбужденный флюорофор испустит один фотон (в видимой части спектра), длина волны которого зависит от типа флюорофора.

Поскольку для того, чтобы флюорофор перешёл в возбуждённое состояние, необходимо поглощение двух фотонов, вероятность испускания флюорофором вторичного фотона пропорциональна квадрату интенсивности возбуждения. Поэтому флуоресценция будет сильнее в случае, когда луч лазера четко сфокусирован, а не рассеян. Максимальная флуоресценция наблюдается в фокальном объёме (объёме, где сфокусирован луч лазера) и демонстрирует резкое уменьшение в области вне фокуса.

Конструкция

В двухфотонном микроскопе луч инфракрасного лазера сфокусирован с помощью собирающей линзы объектива . Обычно используется высокочастотный 80 МГц сапфировый лазер, испускающий импульс с длительностью 100 фемтосекунд, обеспечивающей высокую плотность фотонного потока, которая необходима для двухфотонного поглощения.

Свет, испускаемый флюоресцирующим образцом, усиливается с помощью высокочувствительного фотоумножителя . Поскольку приёмник света является одноканальным, наблюдаемая в данном фокальном объёме интенсивность света формирует один пиксел изображения. Для того чтобы получить двухмерное пиксельное изображение, производится сканирование в фокальной плоскости образца.

Преимущества и недостатки

Использование инфракрасного света для возбуждения флюорофора в исследуемых тканях имеет свои преимущества :

• Длинные волны рассеиваются меньше, чем короткие, что обеспечивает высокое пространственное разрешение.
• Возбуждающие фотоны имеют маленькую энергию, следовательно, они менее разрушительны для тканей (что продлевает жизнь исследуемой ткани).

Но есть и некоторые недостатки:

• Для работы лазера требуются дорогие оптические приборы для обеспечения интенсивности импульса.
• Двухфотонный спектр поглощения флюорофора может сильно меняться в отличие от однофотонного спектра поглощения.
• Луч с длиной волны более 1400 нм значительно поглощается водой в живых тканях.